Biofilter Mediaval för Largemouth Bass- Biofilms egenskaper och tillväxtprestanda
Largemouth bas (Micropterus salmoides), även känd som Kalifornien bas, tillhör Actinopterygii, Perciformes, Centrarchidae, Micropterus. Den är hemma i Kalifornien, USA, och har fördelar som snabb tillväxt, utsökt smak, rik näring och högt ekonomiskt värde. Det har blivit en av de viktiga sötvattensvattenbruksarterna i Kina. Under de senaste åren, mot bakgrund av omvandling och uppgradering av fisket och den kraftfulla utvecklingen av digitalt och intelligent fiske, har industrialiserat återcirkulerande vattenbruk gradvis uppstått. Vattenbruksläget för largemouth bas växlar också från traditionell dammkultur till grönt och effektivt recirkulerande vattenbruksläge. Återcirkulerande vattenbruk har fördelar som vatten- och markbesparing, hög beläggningstäthet och bekväm skötsel. Genom fysiska, biologiska, kemiska metoder och utrustning avlägsnas eller omvandlas fasta suspenderade fasta ämnen och skadliga ämnen i vattenkroppen till ofarliga ämnen, så att vattenkvaliteten möter de odlade arternas normala tillväxtbehov, och därigenom realisera återanvändning av vatten under vattenbruksförhållanden med hög-densitet. Den har uppnått goda ekonomiska fördelar i flera odlade arter.
För närvarande fokuserar forskningen på recirkulerande vattenbruk av largemouth bas främst på reproduktion, fodernäring, val av stam, exakt utfodring, förändringar i vattenmiljön och näringskvalitet. Forskning om inomhusindustriellt återcirkulerande vattenbruk av stormunsabborre fokuserar huvudsakligen på odling av stor-ungfisk, och full-uppfödning av vuxen fisk har inte främjats i stor utsträckning. Den största utmaningen för återcirkulerande vattenbruk är att upprätthålla en god vattenmiljö under hög-densitetsförhållanden för att säkerställa normal tillväxt av de odlade arterna. Vattenrening är kärnan i recirkulerande vattenbruk, och effektiva biofiltermedia för vattenbehandling är grunden för vattenreningssystemet. Även om det finns många rapporter om vattenrening med biofiltermedier, saknas rapporter specifikt om industrialiserat recirkulerande vattenbruk med stor mun, särskilt när det gäller screening av effektiva biofiltermedia för vattenbehandling, den mikrobiella gemenskapsstrukturen för biofilmer på olika biofiltermedia, behandlingseffekter och effekter på tillväxten av de odlade arterna. Tre typer av biofiltermedier valdes ut, bland vilka biofiltermediet med kvadratisk svamp och fluidiserad bäddkula är låg-kostnad och enkla att använda och har använts i stor utsträckning i vattenbruksvattenrening; Mutag Biochip 30 (förkortat Biochip) är en ny typ av biofiltermedia som har dykt upp de senaste åren, med fördelar av slagtålighet och lång livslängd, men dess praktiska tillämpningseffekter har inte rapporterats. För detta ändamål användes 16S rDNA hög-genomströmningssekvenseringsteknik för att analysera biofilmbildningssituationen för de tre vattenbehandlingsbiofiltermedierna, samtidigt som tillväxtsituationen för largemouth bas analyserades, för att sålla bort praktiska vattenbehandlingsbiofiltermedia och tillhandahålla effektiva vattenbehandlingsmedia för largemouth bass industrialiserad recirkulerande vattenbruk.
1. Material och metoder
1.1 Testmaterial
De biofiltermedia som valdes för detta test varfyrkantig svamp, Biochip, ochfluidiserad bäddboll, som visas iBild 1. Det fyrkantiga svampmaterialet är polyuretan, formad som en kub med en sidolängd på 2,0 cm, specifik yta (3,2~3,5)×10⁴ m²/m³. Biochipmaterialet är polyeten, formad som en cirkel med en diameter på 3,0 cm, tjocklek ca 0,11 cm, specifik yta 5,5×10³ m²/m³. Det fluidiserade bäddkulmaterialet är polyeten, effektiv specifik yta 500~800 m²/m³.
1.2 Experimentell gruppering
Den fyrkantiga svampbiofiltermediets behandlingsgrupp sattes som grupp T1, motsvarande mediabiofilm märktes B1 och motsvarande vattenbruksvatten märktes W1; Biochip-biofiltermediebehandlingsgruppen sattes som grupp T2, motsvarande mediabiofilm märktes B2 och motsvarande vattenbruksvatten märktes W2; behandlingsgruppen för biofiltermedia med fluidiserad bädd sattes som grupp T3, motsvarande mediabiofilm märktes B3 och motsvarande vattenbruksvatten märktes W3.
1.3 Vattenbrukssystem
Experimentet utfördes i ett återcirkulerande vattenbrukssystem vid Balidian Comprehensive Experimental Base vid Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries.Det fanns totalt 9 odlingstankar, volym 500 L, effektiv vattenvolym 350 L. Biofiltertanken var gjord av ett plastakvarium som mätte 80 cm långt, 50 cm brett och 50 cm högt, volym 200 L, effektiv vattenvolym 120 L. Odlingstanken och biofiltertanken kopplades samman med en vattenpump för att bilda en intern cirkulation, flödeshastighet 3~4 L/min, med luftning för syresättning, vattenlöst syre hölls över 5 mg/L. Biofiltermedierna grupperades slumpmässigt, varje typ av biofiltermedia hade 3 replikat, varje biofiltertank laddades med 2,0 kg biofiltermedia, samtidigt som en långsam- kolkälla suspenderades. Under biofilmsodlingsperioden byttes 10 % av vattnet dagligen.Inledande vattenkvalitetsindikatorer: Totalt kväve (TN) 9,41 mg/L, Totalt fosfor (TP) 1,02 mg/L, Ammoniakkväve (TAN) 1,26 mg/L, Nitritkväve (NO₂⁻-N) 0,04 mg/L) 70 mg/L, Permanganat-index (L3) mg/L3..
1.4 Testa fisk- och kulturförvaltning
Largemouth bas användes som den odlade arten. Före starten av testet acklimatiserades de i det recirkulerande vattnet i 7 dagar.Testet genomfördes från 11 augusti 2022 till 22 september 2022 och varade i 42 dagar. Largemouth bas utan ytskador, frisk och livlig, valdes ut för gruppering, 60 fiskar lagrades i varje odlingstank, utfodrades två gånger dagligen, matningstiderna var 07:00 på morgonen och 16:00 på eftermiddagen, den dagliga utfodringen stod för cirka 1,0%~1,5% av fiskens totala kroppsmassa. Den initiala kroppsmassan för testfisken var (20,46 ± 0,46) g.
1.5 Provtagning
Vattenprover från biofiltertanken samlades in varannan dag och registrerade indikatorer som vattentemperatur, löst syre, pH-värde och mätning av ammoniakkväve och nitritkväve. Utfodringsmängd, fiskens kroppsmassa i början och slutet av experimentet och överlevnadsgrad registrerades. Efter experimentet samlades 1 L vatten från varje odlingstank med hjälp av sterila vattenuppsamlingspåsar, filtrerades genom ett 0,22 µm filtermembran och förvarades i en -80 graders frys för senare användning. Biofiltermediaprover på 0,5 g togs aseptiskt från varje biofiltertank, lagrades i steriliserat destillerat vatten, skakades kraftigt för att avlägsna mikroorganismer från biofilmytan, filtrerades sedan genom ett 0,22 µm filtermembran och förvarades i en -80 graders frys för senare användning.
1.6 Mätmetoder
1.6.1 Vattenkvalitetsmätning
Vattentemperatur, löst syre och pH-värde detekterades med hjälp av enHACH Hq40d bärbar vattenkvalitetsanalysator. Ammoniakkvävekoncentrationen mättes med användning av Nesslers reagensspektrofotometriska metod. Nitritkvävekoncentration detekterades med användning av den spektrofotometriska saltsyranaftyletylendiaminmetoden.
1.6.2 Vattenbrukets prestandamätning
Beräkningsformlerna för fiskens viktökningshastighet, foderomvandlingsförhållande och överlevnadsgrad är följande.
l Viktökningshastighet= (Slutlig fiskkroppsmassa - Initial fiskkroppsmassa) / Initial body mass × 100 %;
l Feed Conversion Ratio= Foderförbrukning / viktökning;
l Överlevnadsgrad= (Antal fiskar i slutet av experimentet / Initialt antal fiskar i början av experimentet) × 100 %.
1.6.3 Mikrobiell hög-genomströmningssekvensering
Bakteriellt DNA extraherades från vatten och biofilm med hjälp av ett Bacterial DNA Extraction Kit (OMEGA Biotech, USA). Specifika primrar 338F (5'–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3') och 806R (5'–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3') användes för att amplifiera V3- och V4-regionerna av det bakteriella 16S rDNA. PCR använde TransGen AP221-02-reaktionssystemet: 4 µL 5×FastPfu-buffert, 2 µL 2,5 mmol/L dNTPs, 0,4 µL FastPfu-polymeras, 0,8 µL vardera av 5 µmol/L av framåtriktade och omvända B.2SA-primrar, 1 µl B.2SA mall, kompletterad med ddH2O till 20 µL. PCR-reaktionsbetingelser: 95 grader under 3 min; 95 grader i 30 s, 53 grader i 45 s, 72 grader i 1 min, 28 cykler; 72 graders förlängning i 10 min. PCR-amplifiering utfördes på ett PCR-reaktionsinstrument 9700 (Applied Biosystems® GeneAmp®, USA). PCR-produkter renades med användning av pärlor och utsattes sedan för sekvensering. Sekvensering beställdes till Shanghai Majorbio BioPharm Technology Co., Ltd.
1.6.4 Mikrobiell mångfaldsanalys
De rådata som erhölls från sekvensering splitsades först, följt av kvalitetskontrollfiltrering av läskvaliteten och splitsningseffekten, och sekvensriktningskorrigering, vilket resulterade i optimerad data. Efter normalisering av de slutligen erhållna rena data, utfördes OTU (Operational Taxonomic Units) klustringsanalys och taxonomisk analys med 97% likhet. Histogram av proverna ritades med hjälp av Excel, och värmekartor ritades med hjälp av Majorbio Cloud Platform.
1.7 Dataanalys
SPSS 16.0 statistisk programvara användes för signifikansanalys av skillnader, och Duncans metod för variansanalys (ANOVA) användes för flera jämförelser.
2. Resultat och analys
2.1 Biofilmbildningstid för olika biofiltermedia
Som visas iFigur 2,under naturliga biofilmbildningsförhållanden visade ammoniakkvävehalten i vattnet i biofiltertanken en trend med snabb ökning följt av gradvis minskning.Ammoniak-kvävehalteni vattnet i biofiltertanken som motsvarar den kvadratiska svampen nådde sin topp vid 17 dagar, vid 8,13 mg/L, och minskade sedan gradvis,nå den lägsta vid 41 dagar, efteråt kvar omkring 0,20 mg/L, vilket indikerar attbiofilmbildningstiden för den fyrkantiga svampen var cirka 17 dagar. Förändringarna i ammoniak-kvävehalten i vattnet i biofiltertankarna motsvarande Biochip och fluidiserad bäddkulan var i princip desamma och visade fluktuerande förändringar. Ammoniakkvävetoppen visade sig vid 21 dagar, vid 7,88 mg/L respektive 7,57 mg/L, vilket indikerar attbiofilmbildningstiden för Biochip och biofiltermediet med fluidiserad bäddkula var cirka 21 dagar. Ammoniak-kvävehalteni biofiltertankarna motsvarandedessa två medier sjönk till den lägsta vid 43 dagar respektive 45 dagar.
2.2 Förändringar i vattnets pH-värde i olika kulturtankar
FrånFigur 3, kan det ses att det initiala pH-värdet för odlingsvattnet var 7,3. När odlingstiden förlängdes visade pH-värdet på vattnet i varje odlingstank en nedåtgående trend. Efter 12 dagar var pH-värdet för alla odlingstankar mindre än 6,0, vilket är ogynnsamt för tillväxten av de odlade arterna.Därför, efter 12 dagars biofilmbildning, bör man vara uppmärksam på att justera pH-värdet för odlingstankvattnet.
2.3 Analys av mikrobiell gemenskapssammansättning på biofilmer av olika biofiltermedia och i vatten
2.3.1 Mikrobiell gemenskapssammansättning på filumnivå
Som visas iFigur 4,på filumnivå var de dominerande bakterierna på biofilmerna i de tre biofiltermedierna desamma, alla är Proteobacteria, Actinobacteriota, Bacteroidota och Chloroflexi. Deras kombinerade relativa överflöd var 68,96 %, 64,74 % respektive 65,45 %. De dominerande bakterierna i motsvarande odlingsvatten var olika. Den dominerande bakterien i W1 var Actinobacteriota, med en relativ förekomst av 64,66 %. De dominerande bakterierna i W2 och W3 var Proteobacteria, med relativa förekomster av 34,93 % respektive 50,10 %.
Fig. 4 Gemenskapens sammansättning av bakterier i olika biofilm och vatten på fylumnivå
2.3.2 Mikrobiell gemenskapssammansättning på familjenivå
Som visas iFigur 5, på biofilmerna från de tre medierna, var cirka 48 % av bakterierna bakteriesamhällen med relativa överflöd alla mindre än 3 %. De dominerande bakterierna av B1 och B2 var desamma, båda är Xanthomonadaceae, med relativa förekomster av 11,64 % respektive 9,16 %; den dominerande bakterien för B3 var JG30-KF-CM45, med en relativ förekomst av 10,54 %. De dominerande bakterierna i odlingsvattnet skilde sig från de på biofiltermediet. Microbacteriaceae var den absolut dominerande bakterien i W1, med en relativ förekomst av 62,10 %; de dominerande bakterierna i W2, förutom Microbacteriaceae (13,82%), även en viss andel Rhizobiales (8,57%); den dominerande bakterien i W3 var Rhizobiales, med en relativ förekomst av 38,94%, följt av Flavobacteriaceae, med en relativ förekomst av 15,89%.
De 50 bästa arterna på släktnivån räknades. Efter bearbetning av de numeriska värdena visades överflödsförändringarna för olika arter i proverna genom färggradienten hos färgblocken. Resultaten visas iBild 6. Leifsonia var den dominerande bakterien i W1, med en relativ förekomst av 56,16%; de dominerande bakterierna i W2 var Leifsonia (10,30%) och Rhizobiales_Incertae_Sedis (8,47%); den dominerande bakterien i W3 var Rhizobiales_Incertae_Sedis, med en relativ förekomst av 38,92 %. Bland de identifierbara bakterierna på biofilmerna var Thermomonas det dominerande släktet i B1, med en relativ förekomst av 4,71 %; de dominerande släktena i B2 och B3 var Nitrospira, med relativa förekomster av 4,41 % respektive 2,70 %.
Fig. 5 Gemenskapens sammansättning av bakterier i olika biofilmeroch vatten på familjenivå
Fig. 6 Värmekarta över bakteriesamhällets sammansättning i olika biofilmer och vatten på genusnivå
2.4 -Mångfaldsanalys av mikrobiella samhällen på biofilmer av olika biofiltermedia och i vatten
Som visas iTabell 1, Shannon-indexet för de mikrobiella samhällena på biofilmerna från olika medier var större än det för motsvarande odlingsvatten, medan Simpson-indexet var det motsatta. Genom att analysera motsvarande odlingsvatten var bakteriegemenskapens Shannon-index för W2 det högsta, betydligt högre än det för W1 och W3, medan Simpson-indexet var signifikant lägre än det för W1 och W3, vilket indikerar att dess -diversitet var den högsta. Till skillnad från -mångfalden i odlingsvattnet, även om det bakteriella mikrobiella samhället Shannon-index i B2-mediet var det största och Simpson-indexet var det minsta, fanns det ingen signifikant skillnad mellan de tre biofiltermedierna. Sekvenseringstäckningen för alla prover var över 0,990, vilket indikerar att sekvenseringsdjupet kunde återspegla provernas sanna nivå.
2.5 Effekter av olika biofiltermedia på tillväxten av largemouth bas
Tabell 2visar tillväxtsituationen för largemouth bas i de olika biofiltermediagrupperna. Efter 44 dagars odling var den slutliga kroppsmassan och viktökningshastigheten för largemouth bas i gruppen med kvadratisk svampodling signifikant högre än de i grupperna med fluidiserad bäddboll och Biochip, och foderomvandlingsförhållandet var signifikant lägre än i de andra grupperna. Överlevnadsgraden för largemouth bas i varje grupp var över 97%, med ingen signifikant skillnad mellan grupperna.
3. Slutsats och diskussion
3.1 Biofilmbildningstid för olika biofiltermedia
Biofilmer fäster på ytan av biofiltermedia. Biofiltermediets material, struktur och specifika yta är de viktigaste faktorerna som påverkar biofilmbildningen. Det finns två vanliga metoder för biofilmsodling: metoden för naturlig biofilmbildning och metoden för bildande av inokulerad biofilm. Olika metoder för biofilmbildning påverkar biofilmens mognadstid. Hu Xiaobing et al. använde fyra olika metoder för biofilmbildning och resultaten visade att när man använde metoder som tillsats av kitosan, järnjoner och ympning med utsläppt slam för biofilmbildning var mognadstiden för biofilmen kortare än den för den naturliga biofilmbildningsmetoden. Även om tillsats av nyttiga mikroorganismer eller aktiva substanser kan förkorta biofilmsbildningstiden, finns det problem såsom svårigheter att få in inokulat, komplex processkonstruktion och höga kostnader. Guan Min et al., under förhållanden med låg halt av organiskt material, använde direkt råvatten för biofilmbildning, och biofiltertanken startade framgångsrikt genom naturlig biofilmbildning efter cirka 38 dagar. Detta forskningsresultat liknar resultaten från denna studie. Resultaten av denna studie visar att under samma biofilmbildningsförhållanden var biofilmbildningstiden för den fyrkantiga svampen kortare än för de två andra biofiltermedierna. Detta kan vara relaterat till den stora specifika ytarean, starka hydrofilicitet och lättheten att fästa biofilm av den fyrkantiga svampen. Den specifika ytan på den kvadratiska svampen är så hög som 32 000 ~ 35 000 m²/m³, mycket större än de två andra medierna. Dessutom är materialet i den fyrkantiga svampen polyuretan, som expanderar när den utsätts för vatten, har hög hydrofilicitet och bidrar till vidhäftning och tillväxt av mikroorganismer i vattnet. Forskningsresultaten av Li Yong et al. visade också att startprestanda-och ammoniakkväveavlägsnande prestanda för polyuretansvamp var bättre än för polypropen, vilket överensstämmer med resultaten från denna studie. Dessutom, i denna studie, var den specifika ytan för Biochip-biofiltermediet så hög som 5 500 m²/m³, mycket större än den för biofiltermediet med fluidiserad bäddkula, men biofilmsbildningstiden var i princip densamma som för kulmediet med fluidiserad bädd. Detta kan vara relaterat till porstorleken. Vissa studier har påpekat att biofiltermedias inre rumsliga skala påverkar tillväxten av biofilmer. Även om vissa biofiltermedia har en stor specifik yta är deras porer fina och porstorleken är mycket mindre än tjockleken på den mogna biofilmen, vilket lätt kan leda till porblockering, vilket gör det svårt för biofilmen i porerna att nå maximal ackumulering. Porerna i Biochipet är små, vilket resulterar i långsammare biofilmtillväxt och längre biofilmbildningstid.
3.2 Mikrobiell gemenskapssammansättning av biofiltermedia och odlingsvatten
I denna studie var de dominerande bakterierna på biofiltermediet och i motsvarande odlingsvatten olika. Shannon-indexet för biofilmerna på biofiltermediet var större än det för motsvarande odlingsvatten, vilket indikerar att biofiltermediet har effekten att berika mikroorganismer. Detta överensstämmer med forskningsresultaten av Hu Gaoyu et al. Det finns många faktorer som påverkar den mikrobiella samhällsstrukturen, såsom bärartyp, filterdjup, salthalt, koncentration av organiskt material, etc. Samma biofiltermedia, under olika odlingsförhållanden, kommer att ha olika mikrobiella samhällen på biofilmen. Författaren studerade en gång biofilmbildningssituationen för biofiltermedia med fluidiserade bäddkulor i ett recirkulerande vattenbrukssystem för jättesötvattenräkor (Macrobrachium rosenbergii). Resultaten visade att den dominerande filumen på dess biofilm var Firmicutes, medan den dominerande filumen på biofilmen med fluidiserad bädd i denna studie var Proteobacteria. Den främsta orsaken till denna skillnad kan vara de olika vattenbruksmiljöerna. De tre biofiltermedia som användes i denna studie hade samma initiala förutsättningar för att odla biofilmer. Det är möjligt att på grund av mediets olika fysiska egenskaper var den bildade biofilmens tjocklek och inre miljö också olika, vilket resulterade i skillnader i de mikrobiella samhällena. Därför är skillnaden i bärare den främsta orsaken till skillnaderna i mikrobiella samhällen. Vidare, under vattenbruksprocessen, påverkar vattenmiljön och det mikrobiella samhället varandra. Orsakerna till skillnaderna i mikrobiella samhällen kan vara relaterade till miljöfaktorer. Till exempel visade Yuan Cuilins forskning att det totala antalet heterotrofa bakterier i kroppen; Fan Tingyu et al. trodde att pH-värdet avsevärt kan påverka det totala kväveinnehållet i vattnet, och spelar en nyckelroll i spridningen av vattenlevande bakteriesamhällen i flodsektioner i inlandet. Ammoniakkväve, totalfosfor och klorofyll a påverkar också sammansättningen av bakteriesamhällen i vattenförekomsten i varierande grad. De miljöfaktorer som orsakar skillnaderna i mikrobiella samhällens sammansättning i denna studie behöver fortfarande bekräftas ytterligare.
3.3 Effekter av olika biofiltermedia på tillväxten av largemouth bas
Från tillväxtresultaten växte largemouth bas i gruppen med kvadratisk svamp snabbast, med en viktökningshastighet som var betydligt högre än för de andra två medierna, och den lägsta foderomvandlingsförhållandet. Detta överensstämmer med tidigare forskningsresultat. I denna studie genomfördes biofilmbildning och vattenbruk samtidigt. Att döma av biofilmsbildningstiden mognade den fyrkantiga svampens biofilm tidigare, och efter att biofilmen mognat var koncentrationerna av ammoniakkväve och nitritkväve i vattnet alltid lägre än i de två andra medierna. Dessutom har den fyrkantiga svampen en viss filtreringskapacitet, halten av fast suspenderad fast substans i odlingsvattnet var lägre och vattnet var relativt klart. Den bättre tillväxten av largemouth bas i den kvadratiska svampgruppen kan vara relaterad till den goda vattenkvaliteten. Men reningseffekterna av det kvadratiska svampmediet på totalt kväve, totalt fosfor och permanganatindex i vattnet behöver studeras ytterligare. Det är värt att notera att under experimentet visade pH-värdet en generell nedåtgående trend. Efter 12 dagars odling var pH-värdet för alla odlingstankar mindre än 6,0, vilket överensstämmer med forskningsresultaten av Zhang Long et al. Minskningen av pH-värdet beror på att ett stort antal vätejoner produceras under processen att odla biofilmen, vilket leder till att vattnets pH-värde minskar. Under biofilmbildningsprocessen är det därför nödvändigt att omedelbart justera pH-värdet för odlingstankvattnet för att säkerställa att det är inom det normala tillväxtintervallet för den odlade arten. Med tanke på den ekonomiska kostnaden är marknadspriset för kvadratisk svamp 70 ~ 100 RMB/kg, och dess kostnad ligger mellan de två andra biofiltermedierna. I kombination med tillväxtresultaten, på kort sikt, är den fyrkantiga svampen ett relativt praktiskt vattenbehandlingsbiofiltermedium för recirkulerande vattenbruk. Den fyrkantiga svampen har dock dålig seghet och kort livslängd. Dess långsiktiga-brukseffekter och vattenbrukseffekter behöver verifieras ytterligare.
Sammanfattningsvis,under naturliga biofilmbildningsförhållanden har det fyrkantiga biofiltermediet med svamp den kortaste biofilmsbildningstiden, ett måttligt pris, och den slutliga kroppsmassan och viktökningshastigheten för largemouth bas i gruppen med kvadratisk svamp var signifikant högre än för de två andra biofiltermedierna. På kort sikt är det ett relativt praktiskt vattenreningsbiofiltermedium för recirkulerande vattenbruk.